转载分享：Allogene公司靶向DLL3的同种异体CAR-T细胞在小细胞肺癌动物模型中的评估
来源：方德门达 作者：方德门达 关注：233次 更新时间：2023-05-26
作者：方德门达 关注：233次 时间：2023-05-26
“细胞知聊”在往期公众文中介绍过，同种异体CAR-T细胞疗法前景广阔，其利用健康供者的T细胞制造“现成的”CAR-T，可大大缩短患者入组和治疗之间的时间，并降低细胞治疗的成本。
DLL3(delta-like ligand 3)是哺乳动物在胚胎发育过程中表达的Notch家族配体之一，在小细胞肺癌(SCLC)中高表达，而在正常组织中低表达。DLL3靶向抗体-药物偶联物(ADC)已在临床中进行过试验，显示出临床活性且无靶点相关毒性，但可能由于细胞表面低密度，以及有效载荷相关毒性导致剂量上升受限，难以成为ADC技术的靶点。2023年3月，同种异体细胞治疗先驱Allogene公司在«Clinical Cancer Research»发表的一篇题为“Allogeneic CAR-T Cells Targeting DLL3 Are Efficacious and Safe in Preclinical Models of Small Cell Lung Cancer”的研究中，利用大量基于单链可变片段(scFv)的抗DLL3 CAR-T细胞克隆，筛选潜在的临床候选细胞，并证明DLL3 CAR-T细胞在临床前SCLC模型中的强效活性和良好安全性。同时，为了制造不引起移植物抗宿主病(GvHD)的异基因CAR-T细胞，利用转录激活子样效应核酸酶(TALEN)基因编辑技术，从细胞表面去除T细胞受体TRAC位点；并去除CD52，以产生对CD52单抗的耐药性，增加临床试验时的清淋深度。
DLL3在SCLC细胞系、肿瘤和正常组织中的表达情况
原代SCLC RNA-seq数据、癌细胞系百科全书(CCLE)、原代正常组织类型的基因型-组织表达(GTEx)数据库的RNA-seq结果和流式细胞分析表明，虽然在垂体、脑和睾丸中检测到一些DLL3 mRNA，但DLL3在大多数正常组织中不表达。
将筛选的超过50个DLL3抗体设计为具有CD8信号序列、CD8铰链、跨膜结构域、4-1BB共刺激结构域和CD3δ胞内结构域的第二代CARs(图2A)，转导效率≥30%的克隆被选择用于进一步开发。为评估DLL3 CARs的功能，将CAR-T细胞与不同DLL3表达密度的靶细胞共培养，结果显示，不同效应靶细胞比例(E:T)条件下，DLL3 CAR-T细胞能有效杀伤DLL3阳性细胞(图2F)，而对DLL3阴性细胞无细胞毒性。随后，试验选择了6种性能最好的CARs(以颜色显示)进行进一步评估。▲图2.不同E/T比条件下，DLL3 CAR-T细胞对DLL3阳性细胞系的杀伤活性
基于最好的利妥昔单抗关闭设计，确定候选DLL3 CARs
CAR-T细胞疗法有可能对正常组织产生靶点和肿瘤外毒性。因此，在出现意外不良反应或发生CRS的情况下，可以通过CAR关闭功能，达到消除CAR-T细胞的作用。科研人员组装了三种不同的关闭设计(图3A)，并用于上述长期系列杀伤研究中表现最好的6种CARs，最终确定3个主要候选克隆(克隆4-RSR、7-R2S和9-SR2)(图3B和C)，并证明利妥昔单抗可通过抗体依赖细胞介导的细胞毒性(ADCC)，介导CAR-T细胞耗竭。▲图3.基于利妥昔单抗关闭设计的DLL3 CAR-Ts对DLL3+ 细胞具有活性
在多个皮下和全身SCLC肿瘤小鼠模型中(图4)，单次注射候选DLL3 CAR-T细胞可显著控制肿瘤，包括完全抗肿瘤应答。随后，根据脱靶结合分析，克隆9被排除出研究；同时，克隆4-RSR在小鼠血清中产生了较高水平的IFNγ和GM-CSF，具有最大抗肿瘤活性(图4C)，成为潜在的最佳候选细胞。在研究中，将利妥昔单抗给予小鼠后，也能够消除CAR-T细胞的抗肿瘤作用。▲图4.DLL3 CAR-T细胞对已建立的SCLC皮下和全身肿瘤动物有效
本研究通过ELISA验证DLL3克隆的特异性，在细胞毒性试验中使用一组DLL3阴性细胞系，未观察到细胞毒性活性。同时，进行组织交叉反应(TCR)试验，通过与多名健康供者的多个正常组织IHC染色进行筛选，评估DLL3 CARs是否有脱靶结合发生。
在Retrogenix检测中，通过自动荧光显微镜评估过表达超过5,000种人质膜蛋白的HEK293细胞，检测蛋白-蛋白相互作用。其中，克隆4 CAR-Ts与过表达Notch 1的CHO细胞共培养，即使在高E∶T比为6∶1下，也未产生细胞毒性(图5B)；而虽然克隆4溶解了过表达间皮素的CHO细胞(图5B)，但它没有结合或溶解表达内源性间皮素水平的4个细胞系(图5C)，表明与间皮素的相互作用可能需要超生理表达。综上所述，这些数据表明克隆4和克隆7具有可接受的安全性。▲图5.基于细胞微矩阵的结合试验鉴定潜在脱靶结合DLL3 CAR-T的蛋白
人和小鼠的DLL3 RNA在正常垂体和脑组织中表达，提示小鼠是了解脑和垂体潜在毒性的相关毒理模型。科研人员将非转导(NTD)T细胞或DLL3 CAR-T细胞，静脉注射到正常NSG小鼠、携带皮下肿瘤和脑肿瘤小鼠中。实验结果显示，尽管DLL3 RNA在垂体和大脑中有较低水平的表达，但DLL3 CAR-T细胞的耐受性良好；垂体内可见T细胞浸润，但未见组织损伤(图6)。▲图6.小鼠体内脑部和垂体中T细胞浸润和组织损伤情况
同时，在接受NTD T细胞或DLL3 CAR-T细胞治疗的动物中，检测到抗利尿激素和催产素，这表明该区域的激素分泌细胞未被杀伤(图7)。▲图7.小鼠皮下肿瘤安全性研究显示，DLL3 CAR-T治疗后，动物垂体有T细胞浸润，但无组织损伤。
综上所述，这项研究测试了一组广泛的DLL3 CAR-T克隆的活性，最佳候选DLL3 CAR-T细胞在体外和SCLC小鼠模型中，诱导了强效和特异性杀伤SCLC细胞，并具有可接受的安全性。这些数据可以支持未来DLL3 CAR-T细胞用于治疗SCLC的临床开发。
参考资料：
[1] Yi Zhang, Silvia K. Tacheva-Grigorova, Janette Sutton, Zea Melton, Yvonne S.L. Mak, Cecilia Lay, Bryan A. Smith, Tao Sai, Thomas Van Blarcom, Barbra J. Sasu, Siler H. Panowski; Allogeneic CAR T Cells Targeting DLL3 Are Efficacious and Safe in Preclinical Models of Small Cell Lung Cancer. Clin Cancer Res 1 March 2023; 29 (5): 971–985. https://doi.org/10.1158/1078-0432.CCR-22-2293
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